Piccole molecole sintetiche fatte di acidi nucleici che interferiscono con il metabolismo degli RNA. Cosa sono? E come vengono utilizzate per le terapie delle malattie genetiche rare (e non solo)

di Michela Alessandra Denti

Ogni progresso nella comprensione dei meccanismi molecolari alla base della vita è un volano che ci permetterà, nel tempo, di decifrare le cause delle malattie umane e, soprattutto, di disegnare approcci terapeutici innovativi. Ogni successo terapeutico, a sua volta, imprimerà nuova forza alla ricerca su altri meccanismi molecolari fisiologici e patologici.

Nel campo delle terapie a RNA questo circolo virtuoso tra ricerca fondamentale e ricerca applicata è negli ultimi anni quanto mai evidente, e in progressiva accelerazione.

Il termine “terapie a RNA” identifica le terapie che hanno come bersaglio l’RNA, la molecola deputata a trasferire le istruzioni contenute nel DNA di un organismo, e a far sì che queste istruzioni vengano eseguite.L’RNA esiste sotto forma di “RNA non codificanti” che eseguono essi stessi azioni (la traduzione delle proteine, lo splicing dell’RNA etc.) o sotto forma di RNA messaggero (mRNA) che veicola le istruzioni da “tradurre” nel prodotto finale funzionante: le proteine.

Riuscire a ridurre o modulare l’RNA in maniera precisa ed efficace permette quindi di regolare l’espressione del prodotto di un gene senza cambiare il codice genetico originario. In questo senso le terapie a RNA si distinguono dall’editing genomico e dalla terapia genica. Ciò comporta certamente lo svantaggio che tali terapie non siano cure definitive, ma presenta, di contro, due vantaggi: la reversibilitàdel trattamento, poiché non viene modificato direttamente il DNA, e la facilità con cui vengono disegnate, sintetizzate e somministrate le molecole terapeutiche. 

Le terapie a RNA consistono per lo più in corte molecole sintetiche di RNA o di DNA (“oligonucleotidi”), spesso chimicamente modificate per renderle più resistenti alla degradazione da parte degli enzimi presenti nell’organismo. Le due principali modalità d’azione delle terapie a RNA attualmente approvate sono la riduzione della quantità dell’RNA trascritto da un gene, mediante il meccanismo di “RNA interference”, e la regolazione dello “splicing” (un processo di maturazione dell’RNA stesso). Grazie ai progressi nella nostra comprensione dei meccanismi molecolari, sono tuttavia allo studio almeno una decina di altre modalità, tutte accomunate dall’estrema precisione con cui le molecole terapeutiche individuano i loro bersagli a RNA e si legano ad essi. Questa specificitàd’azione si basa su una proprietà naturale degli acidi nucleici, la stessa che tiene insieme la doppia elica del DNA: la complementarità delle basi azotate, ovvero la tendenza dell’adenina a formare legami a ponte di idrogeno con la timina (o l’uracile) e la preferenza della citosina a formare legami a ponte di idrogeno con la guanina, e viceversa. Così una molecola composta da una specifica sequenza di 20 nucleotidi (l’oligonucleotide “antisenso”) sarà in grado di “riconoscere” e legare esclusivamente le molecole di RNA bersaglio (RNA “senso”), in mezzo alle migliaia di altre molecole di RNA.

Poco più di 20 anni fa veniva scoperta l’esistenza nei mammiferi di un meccanismo di degradazione specifica dell’RNA con funzione di immunità molecolare, chiamato RNA interference. Si comprese che questo meccanismo poteva essere stimolato dall’introduzione di corte molecole di RNA a doppio filamento chiamati siRNA (short interfering RNAs) con sequenza identica a quella del bersaglio. Sebbene le potenzialità terapeutiche di questa scoperta fossero chiare sin dal primo momento, si è dovuto attendere il 2018 perché il primo farmaco basato su siRNA fosse approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) e dalla European Medicinal Agency (EMA): patisiran, un siRNA veicolato in nanoparticelle lipidiche e somministrato per via endovenosa, ha come bersaglio l’mRNA della transtiretina nelle cellule del fegato ed è stato approvato per il trattamento della polineuropatia in individui adulti affetti da amiloidosi ereditaria da accumulo di transtiretina (amiloidosi hATTR). Con cadenza annuale altri tre siRNA sono stati approvati da FDA ed EMA, tutti somministrati per via sottocutanea e con tessuto bersaglio il fegato: givosiran nel 2019 per il trattamento di porfiria epatica acuta (AHP); lumasiran nel 2020 per l’iperossaluria primitiva di tipo 1 (PH1); inclisiran nel 2021 per ipercolesterolemia primaria (familiare e non familiare) o dislipidemiamista. In particolare, inclisiran rappresenta il primo farmaco basato su siRNA che abbia come indicazione una malattia non rara: l’ipercolesterolemia familiare colpisce, infatti, un individuo su 250.

Il principale ostacolo incontrato nelle prime fasi dello sviluppo dei farmaci basati su siRNA è stato senz’altro la difficoltà a veicolarli attraverso le barriere fisiologiche presenti nell’organismo umano, fino a farli arrivare nelle cellule dell’organo dove devono operare. Sono state inventate nuove strategie, come la coniugazione dei siRNA con zuccheri che, legandosi a recettori naturali sulla superficie delle cellule bersaglio, consentono ai siRNA di essere “accolti” nelle cellule giuste. Tuttavia, alcuni organi rimangono più facili di altri da raggiungere: non è un caso che gli altri sei farmaci basati su siRNA al momento in fase di trial clinici avanzati siano studiati per malattie del fegato, dei reni o dell’occhio. Dato il crescente interesse per il trattamento di malattie neurologiche e neurodegenerative, moltissima ricerca si sta concentrando sul miglioramento delle strategie per la somministrazione dei farmaci basati su siRNA al cervello ed i primi risultati con siRNA stabilizzati e coniugati a colesterolo ottenuti in modelli animali sono veramente incoraggianti.

In questo senso è interessante osservare come, invece, l’altra classe di terapie a RNA, quella basate sulla modulazione dello splicing dell’mRNA, sebbene allo studio da decenni per il trattamento della Distrofia Muscolare di Duchenne, abbia raccolto i suoi migliori successi nel trattamento di malattie del sistema nervoso centrale. Paradigmatico è il caso di nusinersen, per il trattamento dell’Atrofia Muscolare Spinale (SMA). La SMA è una malattia genetica rara che colpisce i motoneuroni ed è causata dalla mancanza del gene SMN1, e quindi della proteina Smn da esso prodotta. Anni di ricerca fondamentale hanno consentito di appurare che il genoma umano contiene un gene quasi identico a SMN1, chiamato SMN2, il cui mRNA normalmente subisce un processo di splicing che porta alla produzione di una proteina Smn non funzionale. Procedendo nella ricerca sono state identificate le sequenze dell’mRNA responsabili di questa performance “subottimale” di SMN2, fino a ideare nusinersen, un oligonucleotide antisenso che opera legando queste sequenze e “correggendo” così lo splicing dell’mRNA del gene SMN2. Approvato nel 2016, nusinersen, che deve il suo successo al fatto che è somministrato direttamente nel liquido cefalorachidiano con puntura lombare, è stato utilizzato per trattare più di 11.000 malati di SMA nel mondo. Sull’esempio di nusinersen è stato ideato nel 2018 milasen, un oligonucleotide studiato per la correzione dello splicing aberrante del gene MSFD8 per il trattamento della malattia di Battenin una singola paziente, Mila Makovec. L’ideazione di milasen è stata possibile solo grazie ad un attento e laborioso studio dei meccanismi molecolari alterati nel genoma di Mila, ed ha aperto la strada all’ideazione di altri oligonucleotidi per la modulazione dello splicing per malattie ultrarare, che, non coinvolgendo un sufficiente numero di pazienti, non permettono l’esecuzione di trial clinici e vengono definiti studi “n-of-1”.

Nusinersen, milasen, i farmaci a siRNA fin qui approvati, ci insegnano che la ricerca applicata è possibile solo grazie alla ricerca di base, e che per disegnare terapie di precisione efficaci è necessario comprendere i meccanismi molecolari fondamentali della vita. D’altra parte, la scoperta dell’RNA interference si deve ad osservazioni fatte in muffe, piante, vermi e moscerini…     ma questa è un’altra storia!

Michela A. Denti, Professoressa Associata di Biologia Applicata presso il Dipartimento di Biologia Cellulare, Computazionale ed Integrata (CIBIO) dell’Università di Trento.

Per saperne di più:

breve viaggio nella storia dell’RNA interference

1953 Scoperta la struttura a doppia elica del DNA

1978 Uso di un ASO sintetico (Antisense Oligonucleotides) per il controllo dell’espressione genica

1979 Scoperta l’RNasi-H meccanismo utile a tagliare gli ibridi DNA-RNA

1998 Scoperto il meccanismo di RNA interference dagli americani Fire e Mello (che vinsero il Nobel nel 2006), sperimentando sul nematode C. elegans

2001 Scoperta l’esistenza nei mammiferi di un meccanismo di degradazione specifica dell’RNA con funzione di immunità molecolare, chiamato RNA interference. Questo meccanismo poteva essere stimolato dall’introduzione di corte molecole di RNA a doppio filamento chiamati siRNA (short interfering RNAs) con sequenza identica a quella del bersaglio

2003 Completato il sequenziamento del genoma umano

2005 Primo trial clinico basato su siRNA

2018 Primo farmaco basato su siRNA approvato dalla FDA e dalla European Medicinal Agency (EMA): patisiran, un siRNA veicolato in nanoparticelle lipidiche e somministrato per via endovenosa

2019 Secondo farmaco siRNA approvato da FDA ed EMA: givosiran, per il trattamento di porfiria epatica acuta (AHP)

2020 Terzo farmaco siRNA approvato da FDA ed EMA: lumasiran, per l’iperossaluria primitiva di tipo 1 (PH1)

2021 Quarto farmaco siRNA approvato da FDA ed EMA: inclisiran, per ipercolesterolemia primaria (familiare e non familiare) o dislipidemia mista; rappresenta il primo farmaco basato su siRNA che abbia come indicazione una malattia non rara: l’ipercolesterolemia familiare colpisce un individuo su 250